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sexta-feira, 23 de setembro de 2011

COLORAÇÃO DE LAMINAS



Coloração de Loeffler
a) Com uma lâmina limpa e flambada, prepara-se o esfregaço;
b) Deixar secar ao ar;
c) Cobrir o esfregaço com o corante azul de metileno alcalino de Loeffler,
por 60 segundos;
d) Lavar com água corrente, secar ao ar novamente e observar.

Coloração com Safranina
a) Preparar o esfregaço e secar ao ar;
b) Cobrir com solução alcoólica de Safranina 2%;
c) Lavar com água corrente, em abundância;
d) Secar ao ar e observar.
As células estarão coloridas de vermelho.

Coloração negativa com tinta nanquim
a) Colocar uma gota de tinta nanquim em uma lâmina limpa;
b) Misturar à gota, uma pequena porção da colônia bacteriana;
c) Preparar o esfregaço pelo uso de duas lâminas;
d) Secar ao ar e observar.

As células bacterianas brancas irão contrastar com um fundo marrom-escuro ou negro.

Método de Benians
Também é um método de coloração negativa.

a) Colocar no centro da lâmina, uma gota da solução A de Benians;
b) Adicionar à esta gota, uma gota da suspensão bacteriana
ou do macerado de tecido vegetal, homogeneizando bem;
c) Preparar o esfregaço deixando secar ao ar;
d) Com o auxílio de um conta-gotas, molhar o esfregaço com a
solução B de Benians. O esfregaço irá adquirir coloração azulada;
e) Deixar secar ao ar e observar.

As células bacterianas serão observadas como bastonetes brancos em um fundo azul celeste.

Método de Hiss
a) Prepare o esfregaço misturando na lâmina uma gota de soro sangüíneo
e um fragmento da colônia bacteriana obtido de cultura de meio sólido;
b) Secar ao ar e fixar rapidamente pelo calor;
c) Cobrir o esfregaço com Cristal Violeta 0,1% e aquecer a
lâmina até a formação de vapor;
d) Lavar o excesso de corante com solução de CuSO4 . 5 H2O a 20%;
e) Secar cuidadosamente com papel de filtro;
f) Terminar de secar ao ar e observar com objetiva de imersão;
A célula bacteriana será observada com coloração azul-escura e a cápsula com coloração azul-clara.

Visualização de flagelos

Método de Blenden & Goldberg
a)Cubra o esfregaço com solução mordente por 2 a 4 minutos e lave com água corrente;
b)Adicione o reagente de prata amoniacal (pH = 10)
por 30 segundos e lave imediatamente em água corrente;
c)Seque ao ar e faça a observação em microscópio.
Tanto as células bacterianas, quanto os flagelos se apresentarão com coloração marrom-escura ou negra.

Método de Leifson

a)Prepare o esfregaço, de culturas com 24 a 48
horas de incubação, pela técnica de difusão;
b)Cubra o esfregaço com o corante por 10 minutos;
c)Lave cuidadosamente com água de torneira;
d)Cubra o esfregaço com o corante de contraste, por 5-10 minutos;
e)Lave a lâmina com água de torneira, deixe secar ao ar e faça a observação.

Coloração de endósporos

Método de Dorner
a)Prepare o esfregaço por espalhamento e fixe rapidamente pelo calor;
b)Recorte um retângulo de papel de filtro exatamente do tamanho da
lâmina, cobrindo-a;
c)Embeba o papel com solução de fucsina carbólica;
d)Aqueça a lâmina, mantendo-a suspensa sobre a chama ou sobre uma chapa
quente, mantendo-a por 5-10 minutos após haver desprendimento de vapor,
adicionando mais fucsina sempre que necessário;
e)Remova o papel de filtro e faça a descoloração do
esfregaço com álcool ácido por 1 minuto;
f)Seque o esfregaço, cuidadosamente com papel de filtro e depois ao ar;
g)Cubra o esfregaço com solução de nigrosina e seque ao ar;
h)Observe ao microscópio.
As células vegetativas estarão incolores, já os endósporos se
apresentarão vermelhos contrastando com o fundo negro na lâmina.

Método de Dorner

a)Prepare o esfregaço por espalhamento e fixe rapidamente pelo calor;
b)Recorte um retângulo de papel de filtro exatamente do tamanho
da lâmina, cobrindo-a;
c)Embeba o papel com solução de fucsina carbólica;
d)Aqueça a lâmina, mantendo-a suspensa sobre a chama ou sobre uma
chapa quente, mantendo-a por 5-10 minutos após haver desprendimento
de vapor, adicionando mais fucsina sempre que necessário;
e)Remova o papel de filtro e faça a descoloração do esfregaço
com álcool ácido por 1 minuto;
f)Seque o esfregaço, cuidadosamente com papel de filtro e depois ao ar;
g)Cubra o esfregaço com solução de nigrosina e seque ao ar;
h)Observe ao microscópio.
As células vegetativas estarão incolores, já os endósporos se
apresentarão vermelhos contrastando com o fundo negro na lâmina.

Para fins diferenciais

É utilizada para diferenciar bactérias Gram-positivas e Gram-negativas.
a)Prepara-se o esfregaço de uma cultura de 24-48 horas de idade;
b)Cobre-se o esfregaço com solução de Cristal-Violeta por 1 minuto;
c)Lava-se rapidamente com água;
d)Cobre-se o esfregaço com Lugol por 1 minuto, lavando em seguida com água corrente;
e)Faz-se a descoloração com Álcool Etílico absoluto por 30 segundos;
f)Lava-se com água corrente;
g)Colorir com Safranina e lavar com água;
h)Secar ao ar e observar.
As bactérias Gram-positivas serão visualizadas com coloração púrpura ou azul-escuro, já as Gram-negativas serão coradas pela Safranina, com coloração rósea-clara.

Acúmulo de Poli - b - hidroxi - butirato (PbHB)

É utilizado para verificar se a bactéria acumula grânulos de PbHB. Para este teste a colônia bacteriana deverá se desenvolver em meio Sacarose - Peptona - Agar.

a)Prepare um esfregaço homogêneo e delgado, por espalhamento, a partir de uma cultura desenvolvida em meio sólido;
b)Colocar nas duas extremidades da lâmina esfregaços de bactérias sabidamente com resultado positivo e negativo;
c)Secar ao ar, fixar pelo calor, passando rapidamente o verso da lâmina pela chama de uma lamparina;
d)Cobrir o esfregaço com gotas da solução de Sudan Black B, por 15 minutos;
e)Escorrer o excesso de corante e secar ao ar;
f)Descolorir com água e secar novamente ao ar. Nesta fase o esfregaço controle negativo deverá descolorir totalmente e o positivo manter a cor escura;
g)Contrastar com Safranina (solução aquosa a 0,5%), por 5 - 10 segundos;
h)Lavar novamente, secar ao ar e observar.

As inclusões lipídicas se colorem de azul-escuro ou azul-acinzentado, nos pólos da célula bacteriana. O restante da célula se colore de rosa-claro.

OBS:. Na próxima pastagem colocarei os regentes e soluções para uma melhor visualização das laminas.

Espero que a postagem tenha sido útil.

terça-feira, 20 de setembro de 2011

PROTEOMA



A proteômica é a principal área da genômica funcional, complementando os dados gerados pela genômica e a transcriptômica, representando uma ponte de ligação entre os genes e os seus produtos, as proteínas.
Os recentes avanços na proteômica com o aperfeiçoamento e o desenvolvimento de diferentes técnicas analíticas como a eletroforese bidimensional, eletroforese capilar, cromatografia líquida multidimensional e a espectrometria de massas, têm possibilitado o estudo de processos biológicos dinâmicos com a análise sistemática das proteínas expressas pelo genoma.

A proteômica tem possibilitado estudar e determinar:
- O produto de um gene que muitas vezes é impossível de ser obtido a partir da seqüência do DNA;
- Mecanismos como a regulação de proteínas funcionais por proteólise e sua influência na regulação gênica;
- A interação entre proteínas;
- A composição molecular de estruturas celulares como organelas ao nível protéico;
- Indicar se a regulação de um determinado gene ocorre durante a transcrição ou tradução.

O desenvolvimento da proteômica e a sua integração com diferentes técnicas podem contribuir com a compreensão e elucidação do controle genético e os processos moleculares complexos. Atualmente estão em andamento no Laboratório Max Feffer de Genética de Plantas, Departamento de Genética da ESALQ-USP, diferentes projetos de proteoma com o objetivo de estudar as proteínas envolvidas no desenvolvimento da madeira, usando técnicas como a eletroforese bidimensional e a espectrometria de massas. Estes estudos oferecem a oportunidade de uma melhor compreensão dos fatores envolvidos com a formação da madeira para que no futuro seja possível a obtenção de plantas que apresentem um melhor desempenho de desenvolvimento vegetativo e de biomassa, além de uma maior resistência a fatores bióticos e abióticos, atendendo com isso a uma demanda crescente de madeira.

O Laboratório Max Feffer possui um Espectrômetro de Massas, o Q-Tof Ultima da Waters, onde as proteínas são identificadas. O MassLynx e o ProteinLynx são os softwares utilizados para a análise dos resultados obtidos após a identificação.

Pesquisadores podem submeter propostas de pesquisas ao Laboratório Max Feffer, onde serão oferecidas condições para que esses realizem a identificação de suas proteínas utilizando o Espectrômetro de Massas.