Células-Tronco

O desenvolvimento de técnicas de transplante de órgãos sólidos e de medula óssea foi um dos mais fascinantes avanços da medicina no século XX. A virada do século XXI testemunha um desdobramento também fascinante e promissor desta modalidade terapêutica: o uso de células-tronco para regenerar tecidos lesados outrora considerados irreparáveis. Resultados encorajadores de inúmeros estudos com animais de experimentação impulsionaram grupos de diversos centros no mundo a iniciar estudos clínicos com transplante de células-tronco em várias doenças, particularmente as doenças cardiovasculares e neurológicas. Embora ainda estejamos algo distante de entender o mecanismo preciso pelo qual as células-tronco regeneram órgãos lesados, os estudos publicados até o presente momento, incluindo vários estudos envolvendo seres humanos, sugerem haver um benefício real com esta terapia. O presente artigo pretende abordar os aspectos relevantes da terapia celular em doenças cardiovasculares, incluindo conceitos básicos sobre células-tronco, e os principais estudos de animais de experimentação e clínicos publicados até o presente.

Palavras-chave: Células-tronco; terapia celular; doenças cardiovasculares.

Introdução

A segunda metade do século XX foi marcada por fantásticos progressos na área médica, particularmente com relação a novos métodos diagnósticos e novas modalidades terapêuticas. Dentre os inúmeros avanços terapêuticos testemunhados, um dos mais notáveis foi o progresso na área de transplante de órgãos e, em particular, o emprego de células-tronco para a regeneração do sistema hematopoético. Tendo como base experimentos utilizando modelos animais,1 as experiências clínicas iniciais com a restauração da hematopoese através da infusão de células-tronco hematopoéticas2 conduziram ao emprego já bem estabelecido de transplante de medula óssea no tratamento de várias doenças hematológicas benignas3-5 e malignas,6,7 bem como para alguns tumores sólidos.8 O reconhecimento do impacto desta nova modalidade terapêutica culminou com a concessão do Prêmio Nobel de Medicina e Fisiologia em 1990 a Joseph Murray e E Donall Thomas, pioneiros em transplante de órgãos e células.

Na virada do século XXI, um desdobramento da terapia de transplante de órgãos e células ganhou uma nova dimensão. Diferentemente dos conceitos existentes até então (órgãos inteiros sendo substituídos no caso dos transplantes de órgãos, ou células utilizadas para recompor a medula óssea após mieloablação com altas doses de quimioterapia, no caso do transplante de medula óssea), a terapia celular ou terapia regenerativa traz consigo um novo conceito de alterar o curso de lesões orgânicas. Através do uso de células-tronco provenientes de diferentes fontes, tem sido possível, pelo menos nos estudos iniciais já publicados, reverter quadros patológicos que outrora eram considerados irreversíveis. O presente artigo pretende rever os conceitos básicos desta nova modalidade terapêutica, bem como fazer uma sinopse dos dados clínicos já existentes na área de doenças cardiovasculares.



Células-tronco

As células-tronco são células indiferenciadas que têm a capacidade de se diferenciar em células altamente especializadas, ao mesmo tempo em que conseguem se manter no estado indiferenciado. O mecanismo pelo qual as células-tronco conseguem realizar esta dupla função (diferenciação mantendo uma reserva de células indiferenciadas) ainda não está completamente elucidado, embora alguns aspectos importantes já sejam conhecidos. Por exemplo, estudos utilizando tecnologia de análise genética com microchips (microarray) têm permitido, baseados no padrão de expressão gênica destas células, identificar algumas características básicas responsáveis pela manutenção do estado indiferenciado, que incluiriam a capacidade de responder ao hormônio do crescimento e à trombina, a integração com a matriz extracelular via integrina a6-b1, a alta resistência ao estresse através do aumento da expressão de enzimas de reparo de DNA, entre outras.9 Além disso, várias proteínas de sinalização extracelular diferentes têm sido identificadas como tendo papel importante na manutenção do estado indiferenciado das células-tronco, tais como Bmi-1,10 Notch e Wnt,11 Tie2/Angiopoietina-112 e Oct4.13

Células-tronco embrionárias

As células-tronco embrionárias são obtidas da massa celular interna do embrião e possuem a capacidade de se diferenciar em tipos celulares dos três folhetos embrionários (endoderma, mesoderma e ectoderma) tanto in vitro14,15 quanto in vivo,16 o que demonstra a sua pluripotencialidade. O isolamento de células-tronco embrionárias humanas foi reportado pela primeira vez em 1998,17 e desde então tem sido observado um crescimento exponencial no número de experimentos com estas células, envolvendo melhoria nas condições de cultura,18 manipulação genética19 e indução de diferenciação em diferentes tecidos.20-22 Apesar de serem consideradas as mais promissoras das células-tronco em função da sua pluripotencialidade, o conhecimento atual ainda não permite a produção de derivados de células-tronco embrionárias suficientemente puros e funcionais para uso clínico em terapia regenerativa, existindo o perigo real de formação de tumores resultantes da diferenciação desorganizada destas células.23 Além disso, o uso terapêutico destas células tem gerado embates éticos calorosos, justamente em função do fato de as células serem obtidas de embriões humanos.24

Células-tronco de cordão umbilical

O sangue de cordão umbilical é rico em células-tronco, o que tem permitido a sua utilização clínica como fonte alternativa à medula óssea em transplante de medula óssea tanto em crianças25 quanto em adultos.26,27 Estudos recentes têm demonstrado que estas células possuem também um potencial regenerador de tecidos lesados, como demonstrado em modelos experimentais de infarto agudo do miocárdio28,29 e de acidente vascular cerebral.30 Embora haja ainda um longo caminho a ser trilhado em relação à expansão in vitro destas células com o intuito de se obter um número maior para a sua utilização em transplantes e em terapias celulares, dados recentes indicam que elas poderão ser cultivadas e modificadas geneticamente in vitro com este propósito.31 O fato de serem mais facilmente obtidas, a partir de um material que é normalmente descartado, torna sua utilização menos controversa do ponto de vista ético, embora este aspecto ainda esteja longe de ser um ponto pacífico.32

Células-tronco de medula óssea

Estas células são de especial interesse para a medicina regenerativa. Existem evidências substanciais de que células-tronco da medula óssea circulam para o sangue periférico e de volta para a medula óssea, em um processo fisiológico estreitamente regulado por uma complexa interação de citocinas.33,34 Observações recentes de quimerismo cardíaco após transplante de medula óssea podem ser em parte explicadas por este fenômeno fisiológico.35,36 Além disso, evidências indicam que células-tronco, possivelmente originadas da medula óssea, circulam no sangue periférico e se dirigem para tecidos lesados tanto no contexto de doenças hematológicas37 quanto não hematológicas.38 Além de todos estes atributos, as células-tronco da medula óssea são obtidas de maneira relativamente fácil, tornando-as excelentes candidatas na utilização em terapias regenerativas. Os trabalhos utilizando terapias com células de medula óssea serão discutidos mais extensamente a seguir.



Terapias com células-tronco de medula óssea

O estudo de terapias com células-tronco no reparo de tecidos ou órgãos lesados em pacientes portadores de doenças crônico-degenerativas é bastante recente. A primeira descoberta da capacidade das células-tronco de medula óssea em se diferenciarem em células mais especializadas foi reportada em 1998. Em um modelo experimental de lesão muscular induzida quimicamente em camundongos scid/bg, Ferrari e colaboradores demonstraram que células-tronco (precursores miogênicos) da medula óssea de animais adultos podiam migrar para a região muscular lesada e se diferenciar em músculo esquelético.39 Desde esta descoberta, vários outros grupos publicaram evidências de diferenciação de células-tronco de medula óssea de animais adultos em cardiomiócitos,40 células neurais,41,42 hepatócitos43,44 dentre outras.45 Estes achados sinalizavam para uma mudança de paradigma, em que tecidos considerados pós-mitóticos (ou seja, sem capacidade regenerativa) poderiam ser reparados por células precursoras provenientes possivelmente da medula óssea. Por não envolver as mesmas questões filosóficas, éticas e religiosas observadas com a utilização de células-tronco embrionárias, a utilização de células de medula óssea de indivíduos adultos abriu um novo horizonte na medicina reparadora, ou regenerativa, onde não há possibilidade de rejeição imunológica (já que as células são autólogas) nem a necessidade de estoque de células em bancos de tecidos (já que o estoque aparentemente é inesgotável). Mais ainda, as evidências preliminares sugerem que esta nova modalidade terapêutica poderá ser usada em uma vasta gama de doenças crônico-degenerativas, muitas das quais com opções terapêuticas limitadas (quando existentes).

Dentre as doenças crônico-degenerativas passíveis de serem tratadas com células-tronco, as doenças cardiovasculares constituem seguramente as mais extensivamente estudadas até o presente momento. O número de trabalhos envolvendo o uso de células-tronco para regenerar miocárdio (e conseqüentemente melhorar a função cardíaca) em animais de experimentação é considerável. A tabela 1 sumariza os principais estudos de células-tronco em modelos experimentais de doença cardiovascular isquêmica (modelo mais utilizado), publicados até o presente momento.

O primeiro estudo experimental sugerindo haver diferenciação de células-tronco de medula óssea em cardiomiócitos foi reportado por Orlic e colaboradores.40 Células obtidas de medula óssea de camundongos machos transgênicos para a proteína fluorescente verde e separadas por métodos imunomagnéticos (Lin-, c-Kit+) foram injetadas diretamente no miocárdio de camundongos fêmeas C57BL/6, por via transepicárdica, três a cinco horas após a oclusão da artéria coronária. Quando comparados com os animais infartados e não tratados com células-tronco, os dados mostraram melhora significativa nos animais tratados com relação aos parâmetros de função ventricular analisados, bem como com relação à espessura da parede ventricular, sugerindo que fibras musculares teriam sido formadas em função do procedimento. Além disso, a análise da expressão de alguns marcadores indicaram que as novas células formadas eram "funcionalmente competentes", incluindo a expressão de conexina 43, uma proteína responsável pela conexão inter-celular e acoplamento elétrico entre os cardiomiócitos. Depois deste estudo, vários grupos reportaram estudos animais usando células-tronco em cardiopatia isquêmica, mas os resultados têm sido controversos com relação à eficácia e à capacidade de diferenciação das células-tronco em cardiomiócitos46-52 (Tabela 1).

Lastreados nestes resultados promissores em estudos com animais de experimentação, vários grupos iniciaram estudos empregando células-tronco em doenças cardiovasculares em seres humanos. Como pode ser observado na Tabela 2, os trabalhos envolvendo seres humanos publicados até o presente são consideravelmente mais heterogêneos do ponto de vista metodológico, quando comparado ao que se observa com os estudos de animais de experimentação. Por exemplo, as células-tronco nestes estudos têm sido obtidas das fontes mais variadas, como aspirado de medula óssea, aférese de sangue periférico após mobilização com fator de crescimento, bem como com o uso isolado de fator de crescimento. Além disso, os protocolos de separação e manipulação das células pós-coleta também têm sido bastante variados, dificultando a comparação entre os diferentes estudos. Os marcadores de superfície utilizados para caracterização das células que estão sendo infundidas também diferem entre os estudos, alguns reportando inúmeros marcadores celulares53 e outros reportando apenas um marcador.57 De maneira semelhante, os métodos de implantação das células-tronco no miocárdio têm consistido de injeção intracoronária, injeção direta miocárdica transepicárdica sob visualização direta durante cirurgia cardíaca a céu aberto, e injeção miocárdica transendocárdica guiada por mapeamento eletromecânico do coração. Esta última metodologia foi empregada em um estudo pioneiro realizado por pesquisadores do Hospital Pró-Cardíaco, no Rio de Janeiro, e da Universidade Federal do Rio de Janeiro, em colaboração com o Texas Heart Institute.59 Neste estudo, as células foram coletadas da medula óssea de pacientes portadores de doença isquêmica crônica refratária à terapia clínica otimizada. As zonas de miocárdio hibernante identificadas pelo mapeamento eletromecânico foram escolhidas para receber ao todo 3 mL de uma suspensão de células contendo ao todo 2,5 x 107 células.

Outro estudo pioneiro no Brasil na área de cardiologia foi realizado na Bahia, fruto de uma cooperação entre o Hospital Santa Izabel da Santa Casa de Misericórdia da Bahia e o Centro de Pesquisas Gonçalo Moniz - Fiocruz/BA. Utilizando o modelo de cardiopatia chagásica, em que camundongos com doença de Chagas crônica foram tratados com células mononucleares de medula óssea de camundongos consangüíneos por via endovenosa, demonstrou-se uma redução significativa tanto no número de células inflamatórias como no grau de fibrose no miocárdio nos animais tratados quando comparados aos controles.60 Estes dados sugeriam haver um papel para o uso das células-tronco obtidas da medula óssea no tratamento da doença de Chagas. Baseado nestes dados foi iniciado um estudo de fase I envolvendo pacientes portadores de ICC decorrente de miocardiopatia chagásica, em classe funcional III e IV da New York Heart Association. Estes pacientes recebiam as células-tronco diretamente na circulação coronária via cateterismo cardíaco, após exclusão de doença arterial coronariana pela coronariografia. As células mononucleares foram obtidas de cerca de 50 mL de medula óssea dos próprios pacientes, aspirados em pontos diferentes de ambas as cristas ilíacas e separadas por gradiente de densidade com Ficoll. Trinta pacientes já foram submetidos ao procedimento, não tendo sido observadas até o presente momento complicações relacionadas aos procedimentos de coleta e cateterismo cardíaco. Os resultados obtidos dos pacientes tratados e com tempo de seguimento de no mínimo seis meses (N = 10) indicam uma melhora significativa tanto na função cardíaca quanto na qualidade de vida.61

Apesar dos resultados até o momento promissores utilizando células de medula óssea em terapias celulares para cardiopatias, ainda não se sabe quais os tipos de células que são importantes para o processo de reparo dos tecidos. Da mesma forma ainda não se sabe como nem quantos fatores solúveis participam do processo de recrutamento e indução da diferenciação destas células após sua implantação nos tecidos os quais se deseja reparar. Muito ainda precisa ser esclarecido também acerca do mecanismo pelo qual as células-tronco regeneram tecidos lesados. Os dois principais mecanismos reconhecidos até o momento são a transdiferenciação e a fusão celular.62-64 Embora alguns estudos tenham mostrado a geração de células diferenciadas a partir de células-tronco de medula óssea ou de sangue de cordão umbilical, seja por fusão celular ou transdiferenciação, a regeneração de tecidos lesados pode não depender da presença destas células no tecido lesado.

Em um estudo recente, Borlogan e colaboradores, trabalhando com modelo experimental de acidente vascular cerebral em ratos, demonstraram que células-tronco do cordão umbilical humano causam melhora funcional no déficit neurológico apesar de não migrarem para o cérebro, possivelmente através da produção de fatores tróficos neuro-protetores.65

Evidências recentes sugerem que também em cardiopatia isquêmica a presença de células possa não ser necessária para haver a regeneração miocárdica. Gnecchi e colaboradores reportaram os resultados de um estudo experimental utilizando sobrenadante de cultura (meio condicionado) de três tipos de células mesenquimais, todas submetidas a condições de hipóxia: células não manipuladas, células com expressão do gene da proteína fluorescente verde e células com superexpressão do gene Akt. Neste modelo de cardiopatia isquêmica aguda em ratos, o meio condicionado foi injetado na área ao redor do infarto 30 minutos após a oclusão da artéria coronária. No coração dos animais tratados com meio condicionado por células mesenquimais superexpressando Akt foi observada uma redução significativa na área de infarto e no índice apoptótico, quando comparado com os animais tratados com meio condicionado procedente de culturas de células não manipuladas e de células com expressão da proteína fluoresecente verde.66 Estas evidências mais recentes sugerem que ainda temos um longo caminho a percorrer até que tenhamos um entendimento satisfatório sobre o assunto.

Em linha com estes achados mais recentes, uma estratégia que já vem sendo testada para enriquecer a população celular a ser utilizada na terapia é o isolamento de células mesenquimais derivadas da medula óssea. Células-tronco mesenquimais são células clonogênicas não-hematopoiéticas presentes na medula óssea, capazes de se diferenciar em múltiplos tipos celulares de origem mesodérmica e não-mesodérmica. Por serem isoladas e cultivadas in vitro de maneira relativamente fácil e pelo seu potencial de diferenciação, protocolos clínicos utilizando células mesenquimais da medula óssea para o tratamento de doenças sistêmicas, implantação no sítio de tecidos lesados e como veículos para genes em terapias gênicas já estão sendo testados.67



Considerações finais

A área de doenças cardiovasculares é hoje a mais estudada quanto ao potencial terapêutico das células-tronco de medula óssea, ainda havendo muito a ser elucidado com relação a qual seja a melhor célula, a melhor fonte, a melhor forma de implantação no miocárdio e o melhor momento na evolução de cada doença em particular. No entanto, outras áreas já estão também sendo alvo de estudos com esta fonte de células, como doenças neurodegenerativas, auto-imunes, hepatopatias e retinopatias.

Embora os resultados alcançados em várias áreas sejam animadores, pouco se sabe sobre os mecanismos de atuação destas células, quais populações celulares são importantes e quais os fatores necessários para o recrutamento e função destas células. A melhor compreensão destes fenômenos deverá contribuir para o desenvolvimento de estratégias terapêuticas mais eficazes e menos invasivas para doenças crônico-degenerativas.



Referências Bibliográficas

1. Merwin RM, Congdon CC. Repopulation of hematopoietic tissues and blood in lethally x-irradiated mice by homologous bone-marrow cells. J Natl Cancer Inst 1957;19(5):875-84. [ Links ]

2. Thomas ED, Lochte HL Jr, Cannon JH, et al. Supralethal whole body irradiation and isologous marrow transplantation in man. J Clin Invest 1959;38:1709-16. [ Links ]

3. Gaziev J, Lucarelli G. Stem cell transplantation for thalassemia. Reprod Biomed Online 2005;10(1):111-5.

4. Walters MC, Storb R, Patience M, et al. Impact of bone marrow transplantation for symptomatic sickle cell disease: an interim report. Blood 2000;95(6):1918-24.

5. Gluckman E, Auerbach AD, Horowitz HH, et al. Bone marrow transplantation for Fanconi's anemia. Blood 1995;86(7):2.856-62.

6. Child JA, Morgan GJ, Davies FE, et al. High-dose chemotherapy with stem-cell rescue for multiple myeloma. N Eng J Med 2003; 348(19):1875-83.

7. Holmberg LA, Stewart FM. Hematopoietic stem cell transplantation for non Hodgkin's lymphoma. Oncology (Huntingt) 2003;17(5): 627-32.

8. Childs R, Barrett J. Nonmyeloablative stem cell transplantation for solid tumors: expanding the application of allogeneic immunotherapy. Semin Hematol 2002;39(1):63-71.

9. Ramalho-Santos M, Soonsang Y, Matsuzaki Y, et al. "Stemness": Transcriptional profiling of embryonic and adult stem cells. Science 2002;298:597-600.

10. Park I-K, Dalong Q, Kiel M, et al. Bmi-1 is required for maintenance of adult self-renewing haematopoietic stem cells. Nature 2003; 423:302-5.

11. Duncan AW, Rattis FM, DiMascio LN, et al. Integration of Notch and Wnt signaling in hematopoietic stem cell maintenance. Nat Immunol 2005;6(3):314-22.

12. Arai F, Hirao A, Ohmura M, et al. Tie2/Angiopoietin-1 signaling regulates hematopoietic stem cell quiescence in the bone marrow niche. Cell 2004;118:149-61.

13. Niwa H, Miyazaki J, Smith AG. Quantitative expression of Oct-3/4 defines differentiation, dedifferentiation or self-renewal of ES cells. Nat Genet 2000;24:372-8.

14. Evans MJ, Kaufman MH. Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos. Nature 1981;292:154-6.

15. Martin G. Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultures in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells. Proc Natl Acad Sci USA 1981;78:7634-7638.

16. Nagy A, Rossant J, Nagy R, et al. Derivation of completely cell culture-derived mice from early passage embryonic stem cells. Proc Natl Acad Sci USA 1993;90:8424-8.

17. Thomson JA, Itskovitz-Eldor J, Shapiro SS, et al. Embryonic stem cell line from human blastocysts. Science 1998;282:1145-7.

18. Amit M, Margulets V, Segev H, et al. Human feeder layers for human embryonic stem cells. Biol Reprod 2003;68:2150-6.

19. Zwaka TP, Thomson JA. Homologous recombination in human embryonic stem cells. Nat Biotech 2003;21:319-21.

20. Kehat I, Amit M, Gepstein A, et al. Development of cardio-myocytes from human ES cells. Methods in Enzymology 2003; 365:461-73.

21. Schulz TS, Palmarini GM, Noggle SA, et al. Directed neuronal differentiation of human embryonic stem cells. BMC Neuroscience 2003;4;27-41.

22. Assady S, Maor G, Amit M, et al. Insulin production by embryonic stem cells. Diabetes 2001;50:1691-7.

23. Erdo F, Buhrle C, Blunk J, et al. Host-dependent tumorigenesis of embryonic stem cell transplantation in experimental stroke. J Cereb Blood Flow Metab 2003;23:780-5.

24. Lachmann P. Stem cell research - why is it regarded as a threat? EMBO Rep 2001;2:165-8.

25. Gluckman E, Rocha V. Cord blood transplantation for children with acute leukemia: a Eurocord registry analysis. Blood Cells Mol Dis 2004;33(3):271-3.

26. Laughlin MJ, Eapen M, Rubinstein P, et al. Outcomes after transplantation of cord blood or bone marrow from unrelated donors in adults with leukemia. N Engl J Med 2004;351:2.265-75.

27. Rocha V, Labopin M, Sanz G, et al. Transplants of umbilical-cord blood or bone marrow from unrelated donors in adults with acute leukemia. N Engl J Med 2004;351:2276-85.

28. Ma N, Stamm C, Kaminski A, et al. Human cord blood cells induce angiogenesis following myocardial infarction in NOD/scid mice. Cardiovasc Res 2005;66:45-54.

29. Hirata Y, Sata M, Motomura N, et al. Human umbilical cord blood cells improve cardiac function after myocardial infarction. Biochem Biophys Res Comm 2005;327:609-14.

30. Vendrame M, Cassady J, Newcomb J, et al. Infusion of human umbilical cord blood cells in a rat model of stroke dose-dependently rescues behavioral deficits and reduces infarct volume. Stroke 2004; 35:2390-5.

31. Lee MW, Yang MS, Park JS, et al. Isolation of mesenchymal stem cells from cryopreserved human umbilical cord blood. Int J Hematol 2005;81:126-30.

32. Terry LM, Campbell A. Protecting the interests of the child bone marrow donor. Med Law 2004;23:805-19.

33. Wright DE, Wagers AJ, Gulati AP, et al. Physiological migration of hematopoietic stem and progenitor cells. Science 2001;294:1.933-6.

34. Petit I, Goichberg P, Spiegel A, et al. Atypical PKC- regulates SDF-1-mediated migration and development of human CD34+ progenitor cells. J Clin Invest 2005;115:168-76.

35. Quaini F, Urbanek K, Beltrami AP, et al. Quimerism of the transplanted heart. N Engl J Med 2002;346:5-15.

36. Deb A, Wang S, Skelding KA, et al. Bone marrow-derived cardiomyocytes are present in adult human heart - a study of gender-mismatched bone marrow transplantation patients. Circulation 2003;107:1247-9.

37. Xu M, Bruno E, Chao J, et al. The constitutive mobilization of bone marrow-repopulating cells into the peripheral blood in idiopathic myelofibrosis. Blood 2005;105:1699-705.

38. Abe S, Boyer C, Liu X, et al. Cells derived from the circulation contribute to the repair of lung injury. Am J Resp Crit Care Med 2004;170:1158-63.

39. Ferrari G, Cusela-De Angelis G, Coletta M, et al. Muscle regeneration by bone marrow-derived myogenic progenitors. Science 1998; 279:1528-30.

40. Orlic D, Kajstura J, Chimenti S, et al. Bone marrow cells regenerate infracted myocardium. Nature 2001;410:701-5.

41. Mezey E, Chandross KJ, Harta G, et al. Turning blood into brain: cells bearing neuronal antigens generated in vivo from bone marrow. Science 2000;290:1779-82.

42. Brazelton TR, Rossi FMV, Keshet GI, et al. From marrow to brain: expression of neuronal phenotype in adult mice. Science 2000; 290:1775-9.

43. Petersen BE, Bowen WC, Patrene KD, et al. Bone marrow as a potential source of hepatic oval cells. Science 1999;284:1.168-70.

44. Lagasse E, Connors H, Al-Dhalimy M, et al. Purified hematopoietic stem cells can differentiate into hepatocytes in vivo. Nat Med 2000;6:1229-34.